Uzman Doktorlar İçin Bilgilendirme


Maternal kandan DNA izolasyonu, Yeni Nesil Dizileme (NGS) ve Z-skoru hesaplaması ile Fetal Trizomilerin Non-invazif, Moleküler Genetik olarak Prenatal Tanısı


Giriş


Non-invazif, moleküler genetik bir test olan PrenaTest®, maternal kandan Yeni Nesil Dizileme (NGS) yöntemi ile çok yüksek bir doğrulukla fetal Trizomi 21'i teşhis edebilmektedir. İşte bu sebeple PrenaTest®, en son teknolojiyi kullanan, non-invazif bir prenatal tanı testidir. Çok yüksek doğruluk oranı ile halen kullanılan prenatal tarama testlerini tamamlamakta, amniyosentez gibi invazif işlemlerin taşıdığı işleme bağlı fetal kayıp ve komplikasyonlara neden olmamaktadır. PrenaTest® özellikle Trizomi için risk taşıyan 9. gebelik haftasından sonraki gebelerde önerilmektedir.


Bilimsel Temel


PrenaTest®, maternal kanda serbest olarak dolaşan fetal DNA (cffDNA)'nın tespitine dayanmaktadır. Bu genetik materyal, hücre dışında olup küçük parçacıklar halindedir ve maternal kanda serbest olarak dolaşmaktadır. Maternal kanda annenin DNA'sına ek olarak ortalama %2-40 (ortalama %10) oranında serbest fetal DNA (cell-free fetal DNA, cffDNA)[1] bulunmaktadır. Bu fetal genetik materyal parçalanan plasenta hücrelerinden kaynaklanır ve sürekli olarak anne kanına salınır [2]. Bu parçacıkların yarılanma ömrü 2 saatten daha kısadır ve doğumdan sonraki birkaç saatte bu serbest cffDNA parçacıkları tespit edilemeyecek düzeye iner [3].
Non-invazif PrenaTest® ile fetal kaynaklı 21. kromozom parçacıklarının (cffDNA) artışı saptanarak Trizomilerin tanısını koymak mümkün olmaktadır.

Rakamsal bir örnekle oranların açıklanması

 

Örneğin maternal kanda 100 adet 21. kromozom parçacığının dolaştığını varsayalım, diploid fetüslerde bunlardan yaklaşık 10 tanesi fetal 90 tanesi ise maternal kaynaklı olacaktır. Trizomili bir fetüs olması halinde ise toplamda 105 adet 21. kromozom parçacığı olacak ve bunlarda 15 tanesi fetal 90 tanesi ise maternal kaynaklı olacaktır. PrenaTest® yöntemi ile güvenilir bir şekilde işte bu 1:1.05'lik fark saptanmaktadır.

 

PrenaTest®'in hangi risk grubundaki gebelere yapılması uygundur?

 

Günümüzde uygulanan gebe takip yöntemleri ve yasal gerçekler göz önünde bulundurularak, PrenaTest®'in yapılabilmesi için aşağıdaki tüm koşulların sağlanması gereklidir:


  • Genetik Tanı Kanunu ve Genetik Tanı Komisyonları tarafından belirtilen yönergelerde (Guideline) bildirilen şekillerde hastanın uzman hekim veya bir genetik uzmanı tarafından bilgilendirilmesi ve tarafsız olarak önerilerde bulunularak onamının alınması

  • Mevcut gebeliğin kromozomal anormallikler açısında artmış risk taşıması

  • Son adet tarihine göre (SAT) 9. gebelik haftasının geçilmiş olması


PrenaTest®'in kullanımı, aşağıda belirtilen risk faktörlerinden bir veya daha fazlasını taşıyan ve SAT'a göre 9. gebelik haftasını geçmiş gebelerde doğrulanmaktadır:

  • İleri anne yaşı

  • Serum biyokimyasal belirteçlerde bozukluk

  • Ultrasonografide anormal bulgular

  • Aile bireylerinde prenatal tanısı koyulabilecek hastalıkların bulunması

  • Ebeveynlerden birinde yapısal veya sayısal kromozomal anormallik bulunması

  • Teratojenik ve fetotoksik enfeksiyon veya ajanlara maruziyet

  • Diğer risk faktörleri

Doğrulama çalışmalarının sonuçları ilk olarak Nisan 2012'de Almanya'daki bir bilimsel kongrede sunulmuştur. Analizler tamamlanınca en kısa sürede yayımlanacaktır.
Güncel bildirilerinde, Uluslararası Prenatal Tanı Derneği (International Society for Prenatal Diagnosis - ISPD) [4] ve Profesyonel Perinatoloji Uzmanları Derneği (Professional Association of Practising Prenatal Physicians - BVNP) [5], PraenaTest® hakkında anlaşılır ve açıklayıcı bir şekilde tamamlayıcı bilgilendirme yapılmasını belirtmektedir. PraenaTest®, şu an için tam bir tanı testi olarak sınıflandırmaktadır ancak çok yüksek düzeyde anlamlı tanıya yardımcı bir moleküler genetik testtir.
Bu bağlamda, PrenaTest®'in esas amacı trizomi 21 riskini, ilk trimester taramada veya NT ölçümünden sonra özellikle yüksek veya orta riskli gruba giren gebelerde, daha net olarak belirlemektir. Bu sayede yeni nesil dizilemeye dayanan bu ileri teknoloji moleküler genetik yöntem ile invazif tanısal işlemler ve eşlik eden işleme başlı fetal kayıpların belirgin oranda azaltılması mümkün olacaktır [6].


PrenaTest® nasıl çalışmaktadır?


1. Genetik bilgilendirmeyi takiben hasta onam verdiği takdirde, özel olarak geliştirilmiş kan alma tüpüne (LifeCodexx tarafından sağlanan Cell-Free DNA® BCT Streck Innovations) 20 ml periferik venöz kan alınır
2. LifeCodexx tarafından verilen kan alma, saklama ve gönderme bilgileri doğrultusunda alınan örnek LifeCodexx tanı laboratuarına ulaştırılır.
3. Laboratuarda önce plazma ayrılır.
4.Sonra serbest genetik materyal (cfDNA) plazmadan saflaştırılır.
5. Bu saflaştırma işleminde çok az miktarda genetik materyal elde edilir. Analiz için bir 'genomik bilgi' oluşturulmalı ve çoğaltılmaktadır.
6. Ortaya çıkan DNA parçacıkları en son teknoloji analiz cihazları kullanılarak ayrıştırılır. (Illumina HiSeq 2000 teknolojisi ile "massif paralel sekanslama" veya MPS yöntemine dayanan DNA dizileme). Elde edilen diziler belirlenen kriterlere göre sınıflandırılır.
7.Son değerlendirme PrenaTest® DAP.plus yazılımı kullanılarak tamamlanır.

PrenaTest® DAP.plus Yazılımı Kullanılarak Değerlendirme

CE-onaylı PraenaTest® DAP.plus yazılmı özel olarak bu amaç için geliştirilmiş olup, elde edilen dizileri ilgili kromozomlarla eşleştirmekte ve genetik materyalin miktarını belirlemektedir. Buradaki miktar, kalite kriterlerini sağlayan dizilerin içindeki yüzde olarak belirtilmektedir.


Doğrulanmış bir algoritma kullanılarak, kromozomlara ait DNA miktarının, diploid kromozom seti bulunduran olgulardaki normal değer aralıklarını aşp aşmadığı hesaplanır. Normal aralık bir Gaus Çan Eğrisi ile gösterilebilir. Z-skoru olarak da belirtilen istatistik değeri hesaplanır. Z-skoru, çalışılan örneğin içindeki kromozom miktarının referans alınan örnek grubundan ne kadar farklı olduğunun Ortalama Mutlak Sapma (MAD) cinsinden göstergesidir.


Z-skoru aşağıda belirtilen formül ile hesaplanır:

Z(Krm21)örnek = (% (Krm21)örnek – Medyan (Krm21)referans) / MAD(Krm21) referans


Z-skoru, trizomi 21 olmayan gebeliklerde 3 (üç) değerinin altında saptanır. Bu gibi normal gebeliklerde z-skorunun dağılımı Gaus çan eğrisinin normal dağılımı şeklindedir. Z-skoru 3 veya daha fazla ise bu sıklıkla trizomi 21 varlığına işaret eder. Eğer çalışılan örneğin değeri, referans alınan örnek grubunun ortalamasından 3 (üç) ortalama mutlak sapma (MAD) gösteriyorsa, bu demektir ki %99.87 olasılık ile kantitatif olarak anlamlı bir şekilde 21. kromozom fazlalığı var demektir.

Eğer 21. kromozoma ait genetik materyal miktarı belirlenemez ise, PrenaTest® test cevabı "sonuç yok" olarak gelecektir. Dolayısıyla da testi isteyen uzman doktorun, PrenaTest® ile trizomi 21 tanısı koyması mümkün olmayacaktır. Yeniden kan alınarak testin tekrarlanması gerekecektir.


Analiz raporu


LifeCodexx, ilgili uzman doktora PrenaTest® sonucunu z-skoru şeklinde bildirir. Genetik tanı kanunu uyarınca hastaya tanıyı söylemek ve ilgili genetik danışmanı vermek uzman doktorun görevidir. Diğer bir deyişle z-skoruna göre uzman doktor trizomi 21 tanısını yüksek bir doğrulukla onaylar veya dışlayabilir.

İnceleme Yönteminin Güvenilirliği

PrenaTest®'in tanısal doğruluğu, LifeCodexx'in bizzat yürüttüğü klinik çalışmalar sonucunda kanıtlanmıştır (yayn aşamasındadır). Avrupa validasyon çalışmasında (EVS) 468 kan örneği alınmış ve değerlendirilmiştir; İleri bir çalışma olması amacıyla, ortak firmamız olan Sequenom Inc., ABD, ile (Sequenom Kollektif Çalışması, SCS) yürütülmüş; ek olarak 340 örnek analiz edilmiş ve raporlanmıştır. Toplamda 808 örneğin performans analizi yapılmış 75 trizomi 21 olgusu (EVS 41, SCS 34), 14 trizomi 18 olgusu (EVS 8, SCS 6) ve 8 trizomi 13 olgusu (EVS 5 ve SCS 3) yer almıştır. 808 örneğin 806'sı doğru olarak sınıflandırılmıştır. (%99,8). EVS grubunda bir örnekte mevcut trizomi 21 tespit edilememiş (yanlış negatif), bir başka örnekte ise trizomi 18 olmadığı halde trizomi olarak (yanlış pozitif) belirtilmiştir (kromozom 10'da aberrasyon mevcuttur). Trizomi 21 için %98.67 tespit oranına ve %0 yanlış pozitifliğe denk gelmektedir. Analizi yapılan örneklerde bulunan trizomi 13 ve 18 olgularının sayısı henüz yetersiz olduğundan dolayı bu trizomiler için sensitivite ve spesifite hakkında henüz bir sonuca varılamamaktadır.

Genel olarak PrenaTest® analizinin, yapısal kromozomal değişiklikler veya mozaikler hakkında yorum yapması uygun değildir. Ayrca "kaybolan ikiz eşi" olgularında da PrenaTest® sonuçları geçerli olmayabilir.


PrenaTest® ile analizi yapılan serbest fetal DNA'nın kaynağı trofoblast hücreleri olup, bu yöntemle elde edilecek tanı doğruluğu ancak koryon villus örneklemesi işlemi kadar olacaktır. Dolayısıya da, mozaik veya fetoplasental uyumsuzluk gösteren trizomi 21, 18 veya 13'ler belirlenememektedir. Fetoplasental uyumsuzluk durumunda negatif çıkan bir test sonucunun doğmamış çocuk için tam bir gösterge oluşturmayacağı anlamına da gelebilir. Diğer kromozomal anomaliler ve genetik hastalıklar bu analiz yöntemi ile incelenmemektedir, bu yüzden başka sonuçlar çıkartılmamalıdır.


LifeCodexx AG'nin çalışmaları bilimsel ve teknolojik olarak en gelişmiş metodları kullansa da, genetik analizin ne kadar titiz yapıldığından bağımsız olarak riskler tamamen dışlanamaz. Yine de bu riskleri ve olası diğer hataları önlemek için mümkün olan tüm tedbirler ve güvenlik önlemleri alınmaktadır.



Referanslar


[1] Lo et al., Lancet 1997;350:485-487
[2] Bischoff et al., Human Reproduction Update 2004;11:59-67
[3] Lo et al., Am J Hum Genet 1999;64:218-224
[4] ISPD, Prenat Diagn. 2012;32:1-2
[5] BVNP response to non-invasive prenatal diagnostics, www.bvnp.de
[6] Nicolaides, Prent Diagn. 2011; 31:3-6